双功能荧光探针识别脂滴中肼和亚硫酸氢盐

细胞内活性分子在细胞稳态和代谢中发挥着重要作用。例如，生物体内过量氨、肼（N2H4）或其他活性氮物质会与活细胞中的脂质发生反应，产生有毒的脂肪胺，进而导致活体生物中的脂质代谢紊乱。另一方面，细胞内亚硫酸盐/亚硫酸氢盐含量的失衡将导致溶酶体代谢紊乱，并进一步触发脂肪吞噬过程。在这些过程中，过量的肼和亚硫酸盐/亚硫酸氢盐都对脂滴有重要影响，脂滴是一类富含脂质的高活性细胞器。脂滴和其他细胞器之间存在密切的信息和物质交换。定量检测脂滴周围的反应分子，如肼和亚硫酸盐/亚硫酸氢盐，对于评估细胞代谢的生理/病理过程至关重要。

本文作者设计了一种具有以三苯胺骨架修饰有醛基单元的荧光探针TPA-CHO。该探针可以很好的区分和识别溶液或细胞内的N2H4和HSO3-（方案1）。为了进行平行比较，作者设计并开发了一种对照的咔唑探针CBZ-CHO来比较识别特性。原位1H NMR的反应机理表明，TPA-CHO在与N2H4和HSO3-反应后，转化为含有腙或羟基甲磺酸盐单元的产物，导致不同的分子长度和分子内电荷转移(ICT)程度，然后诱导不同颜色的荧光发射。由于三苯胺单元的亲脂性，TPA-CHO可以有效识别脂滴周围的N2H4和HSO3-。

方案1 (A)TPA-CHO的结构。(B) TPA-CHO 脂滴中的分布。(C) 探针对亚硫酸氢盐和肼的识别机制。

探针的分子结构和密度泛函理论计算

通过单晶X射线衍射数据表征了探针的分子结构性质（和图1）。分子具有良好的平面性，分子骨架中两个苯基之间的二面角为10.68°（TPA-CHO）和10.41°（CBZ-CHO）。之后对探针与肼或亚硫酸氢盐产物进行了DFT和TDDFT计算，分析了不同的光谱性质。两种探针均表现出从三苯胺/咔唑到醛的电荷转移，计算出的吸收峰分别为449.97 nm（TPA-CHO）和441.42  nm（CBZ-CHO）。CBZ-CHO 相对于 TPA-CHO 来说较短的吸收峰可能是因为其较低的分子极性，CBZ-CHO和TPA-CHO偶极矩分别为2.8002 Debye和5.8895 Debye。

图1 (A)探针的单晶X射线衍射分子结构和(B)密度泛函理论计算得到的前沿分子轨道。

探针的UV-Vis吸收和荧光特性

作者研究了探针在各种溶剂中的光物理性质（图2）。随着非质子溶剂中溶剂极性的增加，探针TPA-CHO表现出荧光峰红移，红移达到约170 nm（图2A）。相比之下，CBZ-CHO仅表现出135 nm的荧光峰红移，因为咔唑基的给电子能力较低，导致分子极性较小（图2C），大极性赋予分子更强的溶剂化作用。两种探针的荧光峰值与ET(30)呈线性相关（图2B和D）。探针可以用于监测环境的极性，TPA-CHO由于其较大的溶剂化作用而具有较高的灵敏度。

图2 TPA-CHO (A) 和 CBZ-CHO (C) 的归一化荧光光谱，以及 TPA-CHO (B) 和 CBZ-CHO (D) 在各种溶剂中的荧光峰与 ET (30) 的关系。插图：365 nm UV 照射下的相应荧光照片。

对N2H4和HSO3-的荧光响应

在加入HSO3-或N2H4之前，探针TPA-CHO在HEPES-DMSO（1:3，v/v）溶液中显示较弱的荧光发射（630 nm）。而在添加HSO3-或N2H4的情况下，分别在480 nm（TPA-CHO+HSO3）或520 nm（TPA-CHO+N2H4）处出现新的荧光发射峰（图3A和D）。随着时间的推移，TPA-CHO+N2H4/HSO3的荧光发射强度逐渐增加，加入N2H4和HSO3分别在约20 min和120 min内达到荧光强度的饱和状态。

图3 (A,D)在HEPES-DMSO(1:3)中，TPA-CHO (10 μM) 与不同含量的HSO3- (0–36 当量)和肼 (0–33 当量)的荧光光谱变化，v/v）。(B, E)添加60当量后探针 TPA-CHO (10 μM) 的荧光动力学。(B) NaHSO3 和肼 (E)。溶剂：HEPES-DMSO（1:3，v/v），λex = 390 nm。(C, F)不同分析物的 TPA-CHO (10 μM) 荧光强度。

接下来测试了探针的选择性和抗干扰性（图3C和F）。在加入除肼或亚硫酸氢盐以外的其他分析物后，没有明显的现象，而将干扰离子和探针混合在一起时，探针与HSO3-或N2H4反应正常。结果表明，该探针具有良好的选择性和抗干扰性能。此外，溶液表现出从红色（TPA-CHO）到蓝色（TPA-CHO+HSO3）或绿色（TPA-CHO+N2H4）的颜色变化（图3）。探针TPA-CHO的检测限计算为1.71 µM（HSO3-）和N2H4（0.24 µM）。

反应机理

为了了解反应机理，分析了加入N2H4和HSO3-的Job’s plot数据和原位1H NMR。探针与HSO3/N2H4的反应比为1∶1。此外，在TPA-CHO-HSO3的1H NMR光谱中，醛基的氢质子随着5.00 ppm的新质子信号增强而减弱。来自CH=CH的氢质子信号分别移动到7.02 ppm（Hc’’，d）和7.14 ppm（Hb’’，d）。HSO3-的反应机理是HSO3-与醛基的亲核加成反应（图3H、I）。对于TPA-CHO-N2H4（图3H、J），探针TPA-CHO中9.97 ppm（Ha）处醛基氢质子的原始质子信号消失，7.68 ppm（s，1H）和6.80 ppm（s，2H）处新出现的峰值信号分别归因于CH=N（Ha’）和N-NH2（Hd’）。探针对N2H4的反应机理是醛基和N2H4之间的亲核加成反应，形成C=N-NH2基团（方案1）。

基于对分析物产物的DFT和TDDFT计算，肼和亚硫酸氢盐产物表现出从三苯胺到腙（N2H4产物）/羟基甲磺酸盐（HSO3-产物）的电荷转移（图3G）。计算出的吸收峰分别为408.34nm（TPA-CHO-HSO3）和420.86nm（TPA-CHO-N2H4）。相对于TPA-CHO-HSO3，TPA-CHO-N2H4具有更长的分子共轭，TPA-CHO-N2H4产物具有更长的吸收和荧光发射波长。与醛基相比，腙基和羟基甲磺酸基都具有较弱的电子接受能力，从而在吸收光谱和荧光光谱中引起较大的蓝移。

活细胞成像

首先，进行细胞毒性试验来研究TPA-CHO在HeLa细胞中的应用。不同浓度的探针在处理后放置24小时，即使探针浓度达到100 μM，细胞活性仍在80%以上。作者用TPA-CHO和脂滴探针尼罗红进行共定位实验（图4）。共孵育后，绿色和红色通道都显示出明亮的点状荧光区。当两个图像重叠时，可以观察到图像高度重叠，共定位系数为0.84。同时，测量了区域中一条直线的荧光强度，红色和绿色通道的荧光强度具有相同的峰值和趋势，这充分表明TPA-CHO可以特异性靶向脂滴。

图4 TPA-CHO (10 μM) 和脂滴探针尼罗红 (1 μM) 的共定位实验。

二硫化物和肼在细胞代谢中起着重要作用。TPA-CHO能够在两个通道中分别监测脂滴中的亚硫酸氢盐和肼。如图5所示，将HeLa细胞与TPA-CHO孵育30分钟，然后用不同浓度的HSO3-处理。随着HSO3-的浓度逐渐增加，在培养的120 min内绿色荧光也增加。同样，在用不同浓度的肼再孵育20 min后，荧光强度随着肼浓度的增加而逐渐增加。

图5 使用 TPA-CHO 检测 HSO3-或 N2H4的荧光图像。

综上所述，基于三苯胺衍生物和醛作为传感基团的良好光物理性质，作者设计了HSO3-/N2H4荧光探针。由于产生羟基甲磺酸酯/腙基团的接受电子能力不同，导致分子长度和ICT程度不同，从而诱导不同颜色的荧光发射，因此该探针可以区分HSO3-和N2H4。这项工作为检测脂滴中的HSO3-和N2H4带来了极大的便利和可行性。这种双功能荧光探针的结构设计策略也为设计单分子双分析物靶探针提供了重要的思路。

题目：Bifunctional fluorescent probe for the recognition of hydrazine and bisulfite in lipid droplets

作者：Yanyan Han, Yan Huang, Qiaowen Lin, Luyao Tang, Guiyi Yang, Haotian Xin, Songfang Zhao, Ruifang Guan*, Kang-Nan Wang*, Duxia Cao*

引用：Sens.Actuators B Chem. 2023, 393, 134181

DOI：10.1016/j.snb.2023.134181

湖南大学何清课题组